阪崎腸桿菌(E.sakazakii)是一種周生鞭毛、能運(yùn)動、無芽孢的革蘭陰性細(xì)菌，是腸道正常菌群的一種，在一定條件下可引起人和動物致病。感染引起的死亡率高達(dá)50％以上。目前檢測阪崎腸桿菌的方法主要通過常規(guī)生化鑒定和PCR測定16SRNA。常規(guī)檢測方法耗時較長，對檢驗(yàn)員的要求較高，假陰性較高。PCR法檢測費(fèi)用昂貴，對儀器設(shè)備及檢測環(huán)境的要求很高。血清學(xué)檢測成本低廉，易于操作。研究血清學(xué)檢測方法不僅可以輔助常規(guī)檢測，還可以積極探索在臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查中的應(yīng)用。利用阪崎腸桿菌多克隆抗體進(jìn)行免疫檢測研究可以輔助鑒定阪崎腸桿菌，在此基礎(chǔ)上為阪崎腸桿菌血清學(xué)分型菌提供依據(jù)，為進(jìn)一步深入了解該菌提供科學(xué)依據(jù)。本文對阪崎腸桿菌的檢測方法進(jìn)行了綜述。

　　1  阪崎腸桿菌的常規(guī)檢測技術(shù)
   
　　美國食品和藥品管理局(FDA)的檢測方法是國際檢測阪崎腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)生化方法。此外，還有依據(jù)該菌生理生化特征的鑒定方法和PCR法檢測及熒光PCR等分子檢測方法。我國目前尚無該菌檢測方法的國家標(biāo)準(zhǔn)，只有行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)建立了阪崎腸桿菌改進(jìn)的傳統(tǒng)檢測方法(經(jīng)典方法)、普通PCR方法和熒光PCR方法(快速篩選方法)，其中改進(jìn)的傳統(tǒng)方法與FDA方法比較，檢測結(jié)果一致，但效率大大提高，時間縮短1/3～1/2。

　　1.1  生理生化檢測技術(shù)

　　1.1.1  傳統(tǒng)生理生化檢測技術(shù)  目前，阪崎腸桿菌的分離主要是依據(jù)FDA標(biāo)準(zhǔn)方法。具體操作：稱333g樣品(如嬰兒配方奶粉)，分成3份即3×1，3×10，3×100g，分別稀釋成1：10的溶液(用蒸餾水或者蛋白胨緩沖液稀釋)，然后取10ml混合液到90ml腸桿菌增殖肉湯中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，直接取0.1ml增殖菌液涂布平板培養(yǎng)或者用0.01ml的劃線培養(yǎng)或者取1ml的菌液倒平板培養(yǎng)，采用結(jié)晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂(violet red bile glucose agar，VRBGA)培養(yǎng)基在36℃過夜進(jìn)行選擇培養(yǎng)，再挑取5個可疑菌落到胰蛋白酶大豆瓊脂(trypticasesoy agar，TSA)培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)48～72h，挑取黃色菌落，用微量生化法試劑盒(法國梅里埃生物公司，API-20E)和氧化酶法進(jìn)行鑒定。

　　1.1.2  特異性生理生化檢測技術(shù)  Muyt jens等在培養(yǎng)基中加入4-硝基苯酚-α-D-吡喃葡萄糖苷，只有阪崎腸桿菌產(chǎn)生黃色菌落，并且發(fā)現(xiàn)阪崎腸桿菌沒有磷酰胺酶活性，而陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)、成團(tuán)腸桿菌(Enterobacter agglomerates)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)在實(shí)驗(yàn)中磷酰胺酶陽性率分別為72％，89％，100％?？梢姦?葡萄糖苷酶和磷酰胺酶存在與否是阪崎腸桿菌與其他腸桿菌之間2個主要區(qū)別，并進(jìn)一步指出利用該2種酶反應(yīng)隨機(jī)檢測重復(fù)率分別達(dá)89％和81％。但是由于產(chǎn)生的4-硝基苯酚在瓊脂上很容易擴(kuò)散影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察，因而存在一定的局限性。Irvrsen等在(TSA)上加入5-溴4-氯-3-吲哚-α-D-葡萄糖苷酸(XαGle)，α-葡萄糖苷酶的作用于XαGle只有阪崎腸桿菌產(chǎn)生藍(lán)綠色菌落，這種鑒別方法比傳統(tǒng)FDA方法快2d，敏感性達(dá)100％，特異性達(dá)87.2％。但這種鑒別方法產(chǎn)生假陽性較多，比對FDA方法假陰性，各有優(yōu)缺點(diǎn)。Leuseher等發(fā)現(xiàn)，在TSA上加入4-甲基傘形花內(nèi)酮-α-D葡萄糖苷酸(α-MUG)可以鑒別阪崎腸桿菌可疑菌落，可疑菌落在加有α-MUG的營養(yǎng)瓊脂上產(chǎn)生黃色菌落，用紫外線照射發(fā)出熒光，而其他實(shí)驗(yàn)菌株可生成黃色菌落，但在紫外線下不發(fā)出熒光。2004年OhSW等利用α-葡萄糖苷酶作用于底物α-MUG產(chǎn)生黃色菌落的基礎(chǔ)上，對培養(yǎng)條件如培養(yǎng)溫度、氮源的種類和劑量以及選擇性培養(yǎng)基種類進(jìn)行優(yōu)化，指出在胰蛋白胨含量達(dá)20g/L的膽鹽瓊脂上，37℃培養(yǎng)24h具有最佳檢出率。
   
　　2005年OhSW等報道了一種新的調(diào)制嬰兒配方奶中阪崎腸桿菌快速監(jiān)測方法，即96孔板熒光最大或然數(shù)(MPN)法快速計(jì)數(shù)。該方法根據(jù)阪崎腸桿菌產(chǎn)生的α-葡萄糖苷酶能分解α-MUG(OK培養(yǎng)基)產(chǎn)生熒光，對添加該底物的肉湯進(jìn)行熒光檢測，通過96孔微孔板進(jìn)行10管(MPN)法計(jì)數(shù)。分別采用傳統(tǒng)平板法和微量MPN法對蛋白胨水(0.2％)和調(diào)制嬰兒配方奶中的阪崎腸桿菌進(jìn)行定量檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上述2種方法在檢測不同樣品時，其相關(guān)性存在高度一致性。故認(rèn)為，與傳統(tǒng)平板法比較，微量MPN法所需時間較短(<10 h)，更為經(jīng)濟(jì)適用，可應(yīng)用于嬰兒配方奶中阪崎腸桿菌數(shù)量的快速監(jiān)測。2006年2月，國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)和國際乳品聯(lián)盟(IDF)聯(lián)合公布了“乳和乳制品中阪崎腸桿菌的檢測”方法，即ISO/TS 22964 IDF/RM210。該方法2步選擇性培養(yǎng)的溫度均為44℃，整個實(shí)驗(yàn)需5～6d。

　　1.2  分子檢測技術(shù)  目前，美國DuPont Qualicon開發(fā)出一套檢測阪崎腸桿菌程序系統(tǒng)(BAX(r))，并用于和FDA方法進(jìn)行對照檢測。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random Amplified Polymorpgic DNA，RAPD)、脈沖電場凝膠電泳(pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)、染色體DNA分析、核糖核酸分型以及質(zhì)粒分型等都已用于對阪崎腸桿菌分型研究。
   
　　Nazarowec-Write和Farber等用EcoRl對18株阪崎腸桿菌進(jìn)行核糖核酸分型，發(fā)現(xiàn)18株有10種分型。1999年Nazarowee-White和Farber等用Xa11限制性核酸內(nèi)切酶對18株阪崎腸桿菌基因組進(jìn)行切割，通過PFGE進(jìn)行分型分析。結(jié)果顯示，每個菌株都有一個不同的帶型。高旗利等運(yùn)用16S和23 SrDNA的保守區(qū)作為通用引物對16S～23S rDNA間區(qū)序列(IRS)進(jìn)行擴(kuò)增和測序，通過比較阪崎腸桿菌與近源菌株之間16S～23S rDNA間區(qū)序列的基礎(chǔ)上，從設(shè)計(jì)的11對引物中優(yōu)化出一對檢測阪崎腸桿菌的特異性引物，采用該引物對阪崎腸桿菌進(jìn)行檢測，靈敏度達(dá)2.2～5.4 cfu／100 g，并且該方法與FDA方法檢測結(jié)果完全相符。2004年Iversen等利用16S rDNA的測序結(jié)果對126株經(jīng)生化鑒定(API20E和ID32E；bioMerieux)為阪崎腸桿菌菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)菌株都分成4個簇，并且每個簇都和標(biāo)準(zhǔn)菌株存在一定差異，16S rDNA調(diào)查結(jié)果顯示，與標(biāo)準(zhǔn)菌株的差異分別為0.1％～1.2％，1.6％～1.9％，2.2％～2.5％，3.5％；再從不同簇中選出41株阪崎腸桿菌，對其hsp60的測序結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示，同樣形成4個簇，并且與標(biāo)準(zhǔn)菌株的差異分別為1.6％～4％，9.6％～10.8％，4.8％，11.2％。表明該菌具有遺傳多樣性，并且分類的復(fù)雜性比目前認(rèn)為的要大得多。此外還發(fā)現(xiàn)，這種方法與DNA-DNA雜交方法的鑒定結(jié)果不成線形關(guān)系，因而尋找一種更為穩(wěn)定的檢測實(shí)際樣品中阪崎腸桿菌的分子分型檢測技術(shù)顯得很關(guān)鍵。2005年Seo和Brackett報道了針對阪崎腸桿菌局部大分子合成操縱子，即rpsU基因3′末端和primase(dnaG基因5′末端，設(shè)計(jì)引物和TaqMan探針的實(shí)時定量PCR檢測方法。選擇68株腸桿菌和55株非腸桿菌科細(xì)評估該試驗(yàn)的特異性。未經(jīng)富集，經(jīng)50個PCR循環(huán)，該方法能檢測到磷酸鹽緩沖液(PBS)和調(diào)制嬰兒配方奶中100 cfu/ml的阪崎腸桿菌，經(jīng)過增菌培養(yǎng)，可檢測到嬰兒配方粉中1.6 cfu／g的阪崎腸桿菌。該方法能特異性地鑒別阪崎腸桿菌和其他腸桿菌及非腸桿菌科細(xì)菌，無需平板接種和生化鑒定，能節(jié)省5 d。當(dāng)前，對阪崎腸桿菌分子檢測方法，很多學(xué)者在進(jìn)行定量PCR反應(yīng)時都加入了內(nèi)參(internal amplification control或internalpostive control)，內(nèi)參是在PCR反應(yīng)體系內(nèi)部與目的片段一起擴(kuò)增的一段寡核苷酸，用以監(jiān)測整個PCR反應(yīng)體系。在診斷PCR方法中，內(nèi)參主要有2種類型：競爭性和非競爭性。內(nèi)參排除假陰性，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加真實(shí)可靠，在食源性致病菌檢驗(yàn)中的作用不容忽視。目前，許多國家已要求在診斷PCR中強(qiáng)制使用，而國內(nèi)對內(nèi)參的應(yīng)用很少。

　　2  阪崎腸桿菌免疫檢測技術(shù)研究
   
　　血清學(xué)檢測成本低廉，易于操作，制備多克隆抗體可用于輔助常規(guī)生化檢測，快速進(jìn)行中毒診斷。我國國家標(biāo)準(zhǔn)面前仍然使用血清學(xué)鑒定的方法用于沙門菌、志賀菌的分型。血清學(xué)檢測的缺點(diǎn)是易產(chǎn)生交叉反應(yīng)，不適合作為獨(dú)立的檢測方法應(yīng)用。

　　2.1  利用多克隆抗體的免疫檢測研究  何萍等通過碳化二(EDC)法化學(xué)偶聯(lián)成完全抗原(-mcKLH)免疫家兔；制備兔抗鈣激活蛋白43(calcium activated protein43，Cap43)多克隆抗體；用斑點(diǎn)ELISA法檢測抗體效價，經(jīng)辛酸一硫酸銨法初步純化抗體后，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳考馬斯亮監(jiān)檢測其純化后的。結(jié)果經(jīng)免疫11周得到兔抗Cap43多克隆體，抗體效價為1：500。
   
　　王志祥等通過采用家兔背部兩側(cè)多點(diǎn)皮內(nèi)基礎(chǔ)注射，靜脈加強(qiáng)注射，利用飽和硫酸銨(SAS)鹽析和葡聚糖凝膠分析法制備與純化單核增多性李斯特桿菌多克隆抗體，獲得高、高滴度的多抗。以此作為檢測李斯特桿菌(Listeria monocytogenes)的診斷試劑。
   
　　趙志晶等以大腸埃希菌O157：H7免疫新西蘭大耳白免，獲得了抗大腸埃希菌O157：H7的多克隆抗體，經(jīng)提純后效價可達(dá)1：10萬以上。以兔抗血清抗體為捕獲抗體，以單克隆抗體3A5為檢測抗體，建立了雙抗夾心ELISA法，該方法穩(wěn)定性、重復(fù)性良好。對純培養(yǎng)菌液，其檢出限為103～104 cfu／ml，具有良好的敏感性。71株各類菌株的檢測結(jié)果表明，該方法只與大腸埃希菌O157發(fā)生強(qiáng)烈的特異性反應(yīng)，而不與其他菌株的抗原產(chǎn)生交叉反應(yīng)。染菌樣品經(jīng)選擇性增菌后進(jìn)行雙抗夾心ELISA方法檢測，檢出限可達(dá)0.1 cfu／g(或ml)食品，能夠基本滿足食品樣品中大腸埃希菌O157的檢測需要。
   
　　季永峰等通過克隆和表達(dá)金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)基因，制備SEB的多克隆抗體，應(yīng)用于金黃色葡萄球菌引起的食物中毒診斷。成功地克隆了822bpSEB基因，編碼272個氨基酸，在大腸埃希菌E.coli BL21(DE3)株中表達(dá)了重組rSEB分離純化的rSEB能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生抗體，不僅能與rSEB反應(yīng)，并且能夠與天然的SEB特異性反應(yīng)。
   
　　利用多克隆抗體進(jìn)行的免疫檢測研究現(xiàn)已廣泛地應(yīng)用在病原微生物的快速檢測，大大提高了檢測的敏感性和特異性，應(yīng)用酶聯(lián)免疫技術(shù)制造的檢測試劑盒及mini-Vidas(全自動熒光免疫分析儀)等產(chǎn)品，其優(yōu)點(diǎn)是檢測靈敏度高、速度快，可以在48 h內(nèi)快速鑒定沙門菌、大腸埃希菌O157：H7、單核李斯特菌，空腸彎曲桿菌和葡萄球菌腸毒素等。

　　2.2  阪崎腸桿菌多克隆抗體研究的目的及意義  阪崎腸桿菌多克隆抗體研究可用于血清學(xué)檢測該菌，輔助對該菌的生化鑒定。在此基礎(chǔ)上可以為阪崎腸桿菌血清學(xué)分型提供依據(jù)，為進(jìn)一步深入了解該菌提供科學(xué)依據(jù)。因?yàn)樵摼腥疽鸬乃劳雎矢哌_(dá)50％以上，主要是新生兒感染，目前治療手段主要使用氨比西林和慶大霉素等抗生素，治療效果不是很好。通過阪崎腸桿菌多克隆抗體的研究還可以進(jìn)一步探討針對該菌的抗體臨床應(yīng)用，開辟治療阪崎氏腸桿菌感染的新途徑。
   
　　阪崎腸桿菌感染具有發(fā)病急，致死率高等特點(diǎn)，同時該菌的自然來源非常廣泛，并且目前對其致病機(jī)制還不是很清楚，雖然近年來生化檢測技術(shù)在FDA方法的基礎(chǔ)上取得了很大的進(jìn)展，但該方法假陰性較高，仍然存在一些缺陷。所以，進(jìn)一步研究該菌的快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測方法對食源性致病菌感染的控制、疾病的診斷和流行病學(xué)調(diào)查非常關(guān)鍵。

　　3  小結(jié)
   
　　阪崎腸桿菌引發(fā)的食品污染及中毒的事件早以引起世界各國的重視，國際上逐步建立了阪崎腸桿菌的常規(guī)生化等檢測方法和臨床治療方法，我國也在逐步深入研究該菌的各種檢測方法。本研究的最終目標(biāo)就是探索簡便易行的血清學(xué)檢測方法，并建立快速的中毒診斷方法，深入了解阪崎腸桿菌血清學(xué)特性。隨著研究的不斷進(jìn)展，不僅能夠?yàn)槿槠返仁称菲髽I(yè)、質(zhì)檢、衛(wèi)生、環(huán)保等檢測機(jī)構(gòu)提供方便快捷的檢測方法，同時也將為臨床上治療該菌引發(fā)的疾病提供新的治療手段，保護(hù)易感個體，提升該菌所致疾病的醫(yī)療衛(wèi)生水平。